Sulla prospettiva di utilizzare il metodo di trapianto per il trattamento del diabete

Al fine di impedire al diabete mellito di assumere una forma complessa che richiede l'assunzione costante di insulina, è necessario imparare a controllare la malattia. L'ultimo farmaco contribuisce a questo Insumed, che aiuta a sbarazzarsi del diabete "a livello cellulare": il farmaco ripristina la produzione di insulina (che è compromessa nel diabete di tipo 2) e regola la sintesi di questo ormone (che è importante per il diabete di tipo 1).

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Tutti gli ingredienti che compongono il preparato sono realizzati sulla base di materiali vegetali utilizzando la tecnica della biosintesi e sono correlati al corpo umano. Sono ben assorbiti da cellule e tessuti, in quanto sono aminoacidi che compongono le strutture cellulari. Componenti della capsula Insumed normalizzare la produzione di insulina e regolare la glicemia.

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Il lavoro è dedicato allo studio delle possibilità di utilizzare un metodo di trapianto per il trattamento del diabete mellito nella pratica clinica sperimentale. È dimostrato che in futuro questo metodo, a differenza della terapia insulinica, può senza dubbio diventare una cura. È stato sottolineato che è di particolare importanza ottenere materiale sufficiente per il trapianto sotto forma di isolotti pancreatici isolati e isolati dal pancreas, per purificarli dalle impurità e prepararli al trapianto mediante coltivazione utilizzando fattori di crescita. Viene mostrato l'importante ruolo del controllo istologico visivo di ciascun lotto di isole ottenute; gli autori presentano i loro risultati di controllo istologico e istochimico del materiale ottenuto usando tutti i metodi di base altamente specifici per studiare lo stato dell'istostruttura e valutare il contenuto di insulina nelle cellule B attualmente conosciute nel mondo. Sulla base della propria significativa esperienza a lungo termine nei laboratori dell'Europa occidentale, gli autori hanno proposto utili commenti su questioni di natura organizzativa nel condurre ricerche in questa direzione.

Negli ultimi decenni, c'è stato un intenso aumento del numero di pazienti registrati con diabete mellito (DM): da 290 milioni nel 2000 a 366 milioni nel 2011 e 422 milioni nel 2015 [IDF Diabetes Atlas, 2011]. Nel 1992, il diabete è stato riconosciuto dall'OMS come "epidemia non trasmissibile del ventesimo secolo" e in seguito come "minaccia alla pace". Il Kazakistan non fa eccezione. Il numero di pazienti con diabete registrato nella repubblica era: nel 1965 – 29, nel 000 – 1998 (circa lo 93% della popolazione totale), nel 000 – 0,8 (l'2011% del totale popolazione) e nel 208 – 000 (1,3%). A ciò si dovrebbe aggiungere quasi lo stesso numero di persone con diabete ovvio non diagnosticato e 2017-309 con forme di diabete latente. Il numero totale di pazienti con diabete si avvicina quindi a 000-1,7 mila persone. Oggi, il numero di pazienti con diabete è chiaramente più alto del numero di pazienti oncologici e, possibilmente, del numero di pazienti con malattie cardiovascolari (CVD), occupando con fiducia per molti anni le posizioni di n. 100 e n. 000 come causa di morte nella maggior parte dei paesi. Oggi, il diabete mellito ha assunto la posizione n. 150. Per questo indicatore, il fatto più allarmante è che il tasso di crescita dell'incidenza del diabete supera il tasso di crescita del numero di pazienti con CVD e cancro, pari a circa l'000-800% (850%, incluso non rilevato) pazienti secondo IDF) della popolazione totale (2% nel 1). Se la media mondiale raddoppia il numero di pazienti entro 3-1,6 anni, in Kazakistan il loro numero è triplicato in 1,7 anni.

In diversi paesi, secondo il rapporto dell'International Diabetes Federation (2011), l'incidenza del diabete è molto diversa: in Russia nel 2011 – 7,6% della popolazione, Francia – 7,3%, Finlandia – 9,0%, Germania – 8%, Austria – 9,1%, Italia – 7,8%, Polonia – 10,6%, Svezia – 5,7%, Messico – 18%, Israele – 9%, nei Caraibi – da 12,8 % in Antigua al 16,4% in Guyana; un drammatico aumento del numero di pazienti nei paesi del Golfo dura 10-15 anni: in Arabia Saudita – 16,2%, Kuwait – 15,9%, Qatar – 14,1%, Emirati Arabi Uniti – 12,6%; in Giamaica – 15,9%, Cina – 9,3%, India – 8,3%, Malesia – 11,7%, Singapore – 11,1%, USA – 10,8%, Uzbekistan – 4,9%, Kirghizistan – 4,8% e media mondiale – 8,5% [IDF Diabetes Atlas, 2011].

Dal 1922, il principale metodo di trattamento è stata la terapia sostitutiva con preparati di insulina sintetici o animali, la terapia con compresse con preparati farmaceutici in combinazione con molte raccomandazioni riguardanti l'alimentazione, l'attività fisica, ecc. Questo principio consente ai pazienti di essere trattati, ma non curati.

Negli ultimi anni, dopo molti anni di trapianti di animali da esperimento, il metodo di trapianto per il trattamento del diabete, che prevede il trapianto di isole pancreatiche isolate (cellule B) del pancreas che producono l'insulina ormonale, ha gradualmente iniziato ad essere introdotto nella pratica clinica. L'obiettivo finale di questo principio è curare i pazienti. Il miglior risultato raggiunto oggi è completo o prossimo al completo risarcimento delle esigenze del corpo di insulina per circa 2 anni dopo un trapianto (si tratta di un'operazione una tantum e relativamente semplice per trapiantare una sospensione composta da almeno 150-200 mila isole pancreatiche purificate isolate dal pancreas) .

L'idea di trapiantare isole è nata circa 80 anni fa, ma l'impossibilità tecnica di isolare e isolare isole pancreatiche dal tessuto pancreatico era un ostacolo alla sua attuazione. Il suo principale potenziale e ovvio vantaggio è la reale prospettiva esistente di curare il diabete, in contrasto con la terapia sostitutiva dell'insulina.

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La svolta fu il 1967, quando, infine, fu proposto un metodo efficace di isolamento enzimatico delle isole dal pancreas, che cambiò radicalmente la situazione [1]. Quasi immediatamente, nel 1970, i tentativi iniziarono a trapiantare sperimentalmente isole isolate con animali affetti da diabete. Sotto il capo unificante della European Diabetes Association (EASD), questo lavoro è stato piuttosto attivo negli ultimi 30–35 anni. In Europa ci sono molti centri per il trapianto di diabetici in varie cliniche e ospedali, dove, passo dopo passo, i risultati del trapianto vengono gradualmente migliorati. Oggi questo metodo è sperimentale clinico. Il principale svantaggio della terapia sostitutiva con insulina è noto e consiste nel fatto che non appena la somministrazione dell'ormone viene interrotta, esiste una minaccia diretta per la vita del paziente. La terapia sostitutiva con insulina, inoltre, per definizione, non ha prospettive di diventare un metodo di trattamento di un paziente.

A questo problema viene data una seria attenzione in Europa. In tutti questi decenni, i finanziamenti per la ricerca in questa direzione stanno aumentando solo gradualmente. I dati disponibili indicano che non vi sono dubbi sulle prospettive di questo lavoro e che con il tempo questo metodo diventerà gradualmente molto più diffuso in Europa. Oggi, diverse migliaia di pazienti sono stati sottoposti a trapianto sperimentale di isole. L'essenza del metodo trapiantologico per il trattamento del diabete è la seguente:

Le isole pancreatiche vengono isolate dal pancreas degli animali con il metodo enzimatico a seguito della disaggregazione delle fibre del tessuto connettivo, vengono pulite e ricoltivate, dopo di che sono pronte per il trapianto. Per isolare le isole, viene utilizzato l'enzima collagenasi, che rompe le fibre di collagene del tessuto pancreatico esocrino. Come risultato della disaggregazione, si forma una sospensione, costituita da isole isolate, mescolate con frammenti di tessuto esocrino che ha subito la disaggregazione. La loro separazione viene effettuata creando un gradiente di densità usando destrano o ficoll. Le isole in questo caso occupano uno spazio ristretto nell'aereo, da cui vengono selezionate con una pipetta. La pulizia finale viene eseguita lavando 3-4 volte nella soluzione di Hanks seguita da centrifugazione a basse velocità. Il numero di isole danneggiate è in media dal 10 al 15% del numero totale di isole isolate. La coltivazione successiva viene effettuata in un mezzo nutritivo utilizzando fattori di crescita e glucosio. Le sezioni istologiche di isole isolate incorporate nella paraffina sono colorate con insulina usando uno dei numerosi metodi per analizzare lo stato dell'istostruttura e il contenuto di insulina depositata (vedi Fig.) [2–15].

  1. Tessuto del pancreas di un ratto. Complesso di zinco-insulina nelle cellule B. Reazione luminescente allo zinco con toluensolfonilammina chinolina; fetta congelata; × 140. Il team di ricerca sul diabete e la fotografia.
  2. Isolotto pancreatico isolato di un ratto neonatale. Pseudoisocianina dietilica. Istostruttura invariata; significativo contenuto di insulina nelle cellule B (fluorescenza rosso brillante); × 140. La droga e la foto del Diabetological Research Group, 1990.
  3. Tessuto del pancreas di un ratto. Pseudoisocianina dietilica. Istostruttura invariata; significativo contenuto di insulina nelle cellule B (fluorescenza rosso brillante); × 140. Il team di ricerca sul diabete e la fotografia.
  4. Isolotto pancreatico isolato di un ratto neonatale. Victoria 4R. Istostruttura invariata; significativo contenuto di insulina nelle cellule B (colore viola); × 280. Il team di ricerca sul diabete e la fotografia.
  5. Tessuto del pancreas di un ratto. Victoria 4R. Istostruttura invariata; significativo contenuto di insulina nelle cellule B (colore viola), cellule A (colore rosa); × 280. Il team di ricerca sul diabete e la fotografia.
  6. Isolotto pancreatico isolato di un ratto neonatale. Metodo immunoistochimico. Istostruttura invariata; significativo contenuto di insulina nelle cellule B (colore marrone); × 280. Il team di ricerca sul diabete e la fotografia.
  7. Tessuto del pancreas di un ratto. Metodo immunoistochimico. Istostruttura invariata; significativo contenuto di insulina nelle cellule B (colore marrone); × 280. Il team di ricerca sul diabete e la fotografia.

Figura 1. Isolotti pancreatici isolati e purificati e tessuto pancreatico di ratti e ratti neonatali. Istostruttura e contenuto di insulina nelle cellule B. I preparativi e le microfotografie sono stati ottenuti presso il Gruppo di ricerca diabetologica, Karaganda (1977-2016)

L'isolamento di isole di animali adulti viene effettuato in un modo leggermente diverso: una soluzione di collagenasi viene introdotta nell'arteria del pancreas, cioè la rottura delle fibre di collagene avviene all'interno del tessuto.

Il trapianto nell'esperimento viene eseguito più spesso nel tessuto epatico mediante iniezione di una sospensione di isolotto nella vena porta (ci sono opzioni per il trapianto sotto la pelle, nel letto muscolare, ecc.) Mediante una singola iniezione di almeno 150 – 000. Attualmente, i risultati del trapianto sono allo studio certamente, tuttavia oggi sono più propensi a trapiantare nel tessuto epatico.

La parte principale e più costosa del lavoro è ottenere materiale, ad es. colture di isolotti isolati e purificati nelle quantità richieste. Il componente chirurgico non richiede una sala operatoria speciale (5-10% di tutti gli sforzi e i costi).

Oggi, lungi da tutti i problemi in quest'area del diabete mondiale, sono completamente risolti, ma, senza dubbio, una parte significativa di questo percorso è stata coperta. Il componente principale è la creazione di metodi per ottenere una sospensione altamente purificata di isole isolate (animali e donatori) nelle quantità richieste. A tal fine, i gruppi sono organizzati in centri di trapianto che si occupano di problemi correlati, che possono essere suddivisi condizionatamente in due gruppi: 1) migliorare la tecnologia di isolamento e preparazione delle isole pancreatiche per il trapianto sperimentale (animale) e sperimentale-clinico (paziente); 2) lo studio dei risultati a lungo termine del trapianto.

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Tali divisioni comprendono istologi e istochemisti altamente professionali con una vasta esperienza come istologo (senza istruzione superiore o con istruzione secondaria).

Nell'istologia e nell'istocchimica del pancreas negli ultimi 50-60 anni, il livello del lavoro manuale è stato preservato quasi completamente, poiché è impossibile integrare la tecnologia delle macchine in questo processo, in modo simile a come se si tenta di sostituire il lavoro manuale del restauratore di vernici con il lavoro delle macchine; secondo l'esperienza del nostro lavoro, se prendiamo tutto il lavoro manuale di un istologo del pancreas al 100% nel 1964, nel 2015 il suo volume ammontava almeno al 95–98% del livello del 1964, vale a dire. quasi nessun movimento.

Sembra appropriata la seguente versione della possibile organizzazione strutturale del lavoro.

  1. Gruppo 1 (laboratorio) per migliorare l'isolamento e la coltivazione delle isole pancreatiche. Composizione: preparatori istologi con una lunga esperienza ed esperienza in istologia pratica e istologia del tessuto pancreatico, oltre a un supervisore (con formazione medica), uno specialista istologo con esperienza in istologia pancreatica pratica.

Compiti del gruppo:

  1. miglioramento dei metodi per l'isolamento delle isole pancreatiche da parte dell'enzima collagenasi;
  2. migliorare la purificazione del materiale ottenuto;
  3. migliorare la coltivazione di isole preparandole al trapianto sperimentale di animali.

Obiettivi finali in conformità con gli obiettivi:

a) ottenere il numero massimo di isole con una percentuale minima di danni;

b) massima pulizia delle isole dalle impurità sotto forma di frammenti di tessuto esocrino, frammenti di isolotti non vitali danneggiati;

c) miglioramento dei metodi di coltivazione: selezione dei mezzi nutritivi e dei fattori di crescita più adatti che contribuiscono alla crescita e alla differenziazione delle cellule migliori e più rapide;

d) padroneggiare i metodi di incapsulamento delle isole in preparazione al trapianto.

  1. Trapianto sperimentale di gruppo 2. Avrebbe senso organizzarlo come una struttura separata funzionante all'interno dei centri o dipartimenti di trapianto esistenti nelle città in cui esistono.

Strutturalmente, i gruppi possono far parte di varie istituzioni, ma collaborando allo stesso programma. Nella selezione di istologi e supervisori, i candidati dovrebbero preferibilmente:

  1. essere in grado di rimuovere autonomamente il pancreas da un animale sperimentale, ripararlo, eseguire il cablaggio, preparare sezioni e colorarle usando due delle tecniche descritte in questo articolo con la stessa qualità sotto la supervisione di specialisti per tutte le procedure;
  2. per il gestore, inoltre, disporre di pubblicazioni che utilizzano metodi istologici per la colorazione del tessuto pancreatico. Il gruppo 1 (laboratorio) non dovrebbe essere distratto dall'istruzione, dalla specializzazione, dalla formazione di studenti universitari, dottorandi, ecc., Che dovrebbero essere ufficialmente riflessi nella missione e confermati dall'ordine pertinente del capo, vietando tutte le attività estranee, poiché il suo compito è quello di essere un'unità altamente specializzata, e non un centro di formazione part-time.

I campioni di istologo devono essere scelti tra gli istologi di laboratorio senza istruzione superiore, che hanno una lunga esperienza continua, almeno 5 anni, in istologia pratica come farmacologo o assistente di laboratorio e hanno lavorato con il tessuto pancreatico per almeno 2-3 anni.

A proposito di finanziamenti. In tutte le fasi, i cui compiti sono definiti sopra e associati all'ottenimento di una cultura di alta qualità delle isole isolate, il finanziamento non è richiesto nell'ambito del sistema di sovvenzione, ma costante, come centri di diverso profilo (perinatale, cardiologico, ecc.), Nel caso in cui si verifichi questo problema ritenuto dalle autorità superiori veramente pertinente e meritevole di tale decisione. Senza risolvere il problema del finanziamento, l'organizzazione del laboratorio può essere sospesa. Alla fine, prima o poi dovremo probabilmente trovare una soluzione positiva al problema del finanziamento, poiché l'incidenza sempre crescente del diabete eserciterà una pressione crescente.

I trapianti di organi (cuore, reni, ecc.) Sono gravati dalla necessità di risolvere una serie di complessi problemi tecnici e organizzativi, come la complessità tecnica del trapianto, la ricerca di donatori e l'incompatibilità immunologica. È facile notare che il trapianto di isolotti isolati è una procedura relativamente semplice, in misura molto minore gravata dai problemi di cui sopra caratteristici dei trapianti di organi.

Considerando alcune difficoltà relative alla ricerca di metodi di monitoraggio istologico dello stato delle isole isolate, gli autori forniscono di seguito descrizioni dettagliate della fissazione e della pubblicazione del tessuto pancreatico e metodi di colorazione delle sezioni di insulina.

La procedura per la colorazione del tessuto pancreatico con aldeiduchsina Gomori nella nostra modifica

1) xilene – 5 min; 2) xilene n. 2 – 5 min; 3) xilene n. 3 – 5 min; 4) abs. alcool 100º n. 1 – 5 minuti; 5) abs. alcool n. 2 – 5 minuti; 6) alcool 80º – 5 min; 7) acqua. acqua – 5 min; 8) agente ossidante – 2 min; 9) soluzione di acido ossalico al 2% fino allo scolorimento; 10) dist. acqua – 5 min; 11) aldeide-fucsina ("MERCK", Germania; "SERVA", Germania) – 5-7 minuti; 12) 70º alcool acidificato 1 – per differenziare; 13) 70 o alcool acidificato n. 2 – per differenziare; 14) Miscela di Halmi – 1 min;

  1. Dist. acqua – 5 min; 16) dist. acqua – 5 min; 17) abs. alcool n. 3 – 5 minuti; 18) abs. alcool n. 4 – 5 minuti; 19) xilene n. 3 – 5 min; 20) xilene n. 4 – 5 min; 21) la conclusione sul balsamo. Risultato: l'insulina diventa viola (vedere Fig., Pos. 1 e 2).
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Metodo per la colorazione del tessuto pancreatico con dietil pseudoisocianina secondo Coalson

1) xilene n. 1 – 5 min; 2) xilene n. 2 – 5 min; 3) xilene n. 3 – 5 min; 4) abs. alcool 100º n. 1 – 5 minuti; 5) alcool 90º – 5 min; 6) alcool 80º – 5 min; 7) acqua acqua – 5 min; 8) agente ossidante – 2 min; 9) soluzione al 2% di acido ossalico – fino allo scolorimento; 10) dist. acqua – 5 min; 11) Soluzione acquosa allo 0,4% di pseudoisocianina (prodotta da SERVA, Germania) – 15-20 min; 12) 70º alcool acidificato 1 – per differenziare; 13) sciacquare in 2 porzioni di dist. acqua e lasciare in frigorifero per 2 ore; 14) microscopia a luminescenza (lunghezza d'onda 360–370 nm; filtro luce eccitante giallo sulla lampada; filtro di blocco sull'oculare). Risultato: l'insulina nelle cellule B si illumina con una luce rossa brillante (vedere fig., Pos. 3 e 4).

La procedura per la colorazione del tessuto pancreatico con il reagente Victoria 4R (dimetilnaftilmetano, indice di colore 42563)

soluzioni:

  1. Soluzione mordenzante: liquido Buena refrigerato (100 ml) + alumocromo (3-4 g).
  2. Agente ossidante: soluzione KMnO allo 0,3%4 (50 ml) + 0,3% di soluzione di acido solforico.
  3. Soluzione "Victoria Blue": alcool 96º + reagente "Victoria 4R" (1 g).
  4. Soluzione colorante: soluzione Victoria Blue (25 ml) + alcool 96º (100 ml) + glicerina (300 ml) + 1% di acido acetico glaciale (25 ml). I risultati migliori sono stati ottenuti 10-20 giorni dopo la preparazione della soluzione.

procedure:

1) fissazione del pancreas nel liquido Buena 24–48 ore; risciacquare con alcool 70º; 2) versando in paraffina; 3) preparare sezioni con uno spessore di 5 μm; 4) posizionare le sezioni di paraffina brevemente in acqua e quindi nella soluzione di attacco per 24-72 ore a +37 ºС; 5) sciacquare le sezioni in acqua corrente fino allo scolorimento; 6) un agente ossidante – 3-5 minuti; 7) sciacquare bene in acqua; 8) sciacquare in una soluzione di bisolfito di sodio al 2-5% per 1 minuto; 9) sciacquare bene in acqua; 10) 70º alcol – 1 min; 11) colorazione con una soluzione di colorazione per 45 minuti – 24 ore a temperatura ambiente, le cellule B sono colorate di blu; 12) risciacquare in acqua; 13) differenziare in alcool 70º per scolorire altri tipi di cellule; 14) sciacquare in acqua distillata per 1 minuto; 15) colorazione con una soluzione di floxina allo 0,5% per 30-120 s;

sciacquare in acqua distillata per 1 minuto; 17) soluzione al 5% di acido tungsteno fosforoso – 1-2 minuti; 18) sciacquare in acqua corrente per 1-2 minuti fino a quando il colore rosso della floxina ritorna; 19) risciacquare in acqua distillata; 20) colorazione con una soluzione acquosa allo 0,5% di "Light Green" 1-2 minuti; 21) disidratazione 2 volte in alcool a 96º, illuminazione in xilene e colata in balsamo.

I granuli di insulina nelle cellule B sono di colore blu. A cellule in rosso. I nuclei sono rossi, il tessuto esocrino è rosa violaceo, le fibre di collagene sono verdi, le fibre elastiche sono blu (vedi fig., Pos. 5 e 6).

Metodo immunoistochimico per la colorazione dell'insulina nelle cellule B.

Per la verniciatura vengono utilizzati set standard pronti di reagenti prodotti da associazioni di produzione straniere, in cui il numero di procedure di verniciatura è ridotto al minimo e non richiede un dipendente altamente qualificato. Al costo della colorazione di un farmaco, il metodo è molte volte più costoso dei metodi sopra descritti e non è paragonabile al metodo aldeide fucsina e al metodo Victoria 4R, che sono significativamente superiori al metodo immunoistochimico per valutare lo stato istostrutturale delle isole pancreatiche e del tessuto esocrino. Il complesso insulino – anticorpo colora un colore marrone saturo (vedi fig., Pos. 7 e 8).

risultati

  1. Sulla questione n. 3 "Diabete mellito" nella Repubblica del Kazakistan non esiste ancora un istituto di questo profilo o centri di ricerca sul diabete, in contrasto con i primi due problemi di medicina: n. 1 "Malattie cardiovascolari" e n. 2 "Malattie oncologiche" (ci sono cardiocentri in quasi tutte le aree, centri speciali per cardiochirurgia e centri oncologici, nonché istituti di ricerca specializzati). In futuro, a causa della continua intensa crescita della prevalenza del diabete, la crescente gravità del problema porterà prima o poi alla necessità di una tale struttura sperimentale-clinica.
  2. In questa direzione è in corso un lavoro di routine paziente e scrupoloso, per il quale dobbiamo essere preparati. Esiste un'opzione alternativa, vale a dire, nei prossimi 5-10 anni, dovrebbero essere previsti ulteriori progressi in questo settore, dopo di che possiamo intensificare il nostro lavoro.
  3. Secondo le tendenze attuali, il trattamento dei trapianti per il diabete ha certamente buone prospettive per diventare un trattamento più radicale per il diabete. Le spese finali saranno ovviamente notevolmente inferiori: basti dire che ad oggi è improbabile che siano necessari centri chirurgici speciali per il trapianto di isole nella fase iniziale, poiché l'intera parte chirurgica del trapianto di isole oggi non presenta alcuna particolare complessità tecnica.

Il direttore è grato alle associazioni di produzione Boehringer Mannheim >> (ΦPΓ),> (ΦPΓ), SERVA (Germania), FERAK (Germania), MERCK (Germania), SARTORIUS (Germania), Pharmacia Fine Chemicals "(Svezia) per i reagenti e i preparati necessari per lo svolgimento della ricerca che sono stati forniti gratuitamente per molti anni.

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