Cu privire la perspectivele utilizării metodei de transplant pentru tratamentul diabetului

Lucrarea este dedicată studiului posibilităților de utilizare a unei metode de transplant pentru tratamentul diabetului zaharat în practica clinică experimentală. Este demonstrat că în viitor această metodă, spre deosebire de terapia cu insulină, poate deveni, fără îndoială, un remediu. S-a subliniat că este deosebit de importantă obținerea de materiale suficiente pentru transplant sub formă de insule pancreatice izolate și izolate de pancreas, pentru a le purifica de impurități și a le pregăti pentru transplant prin cultivare folosind factori de creștere. Este prezentat rolul important al controlului vizual histologic al fiecărui lot de insule obținute; autorii își prezintă propriile rezultate ale controlului histologic și histochimic al materialului obținut folosind modificate de ei toate metodele de bază foarte cunoscute în lume pentru studierea stării histostructurii și evaluarea conținutului de insulină în celulele B. Pe baza propriei experiențe semnificative pe termen lung în laboratoarele din vestul Europei, autorii au propus comentarii utile asupra problemelor de natură organizațională atunci când efectuează cercetări în această direcție.

În ultimele decenii, a existat o creștere intensă a numărului de pacienți înregistrați cu diabet zaharat (DM): de la 290 milioane în 2000 la 366 milioane în 2011 și 422 milioane în 2015 [IDF Diabetes Atlas, 2011]. În 1992, diabetul a fost recunoscut de OMS ca „epidemie necomunicabilă a secolului XX” și mai târziu ca „amenințare pentru pace”. Kazahstanul nu face excepție. Numărul de pacienți cu diabet înregistrat în republică a fost: în 1965 – 29, în 000 – 1998 (aproximativ 93% din totalul populației), în 000 – 0,8 (2011% din total populație) și în 208 – 000 (1,3%). La acestea ar trebui să se adauge aproape același număr de persoane cu diabet evident nediagnosticat și 2017-309 cu forme latente de diabet. Numărul total de pacienți cu diabet se apropie astfel de 000-1,7 de mii de oameni. Astăzi, numărul de pacienți cu diabet este în mod clar mai mare decât numărul de pacienți cu cancer și, eventual, numărul de pacienți cu boli cardiovasculare (BCV), ocupând cu încredere timp de mulți ani pozițiile nr. 100 și nr. 000 ca fiind cauza decesului în majoritatea țărilor. Astăzi, diabetul zaharat a luat poziția nr. 150 pentru acest indicator. Cel mai alarmant este faptul că rata de creștere a incidenței diabetului depășește rata de creștere a numărului de pacienți cu BCV și cancer, ridicându-se la aproximativ 000-800% (850%, inclusiv nedetectat). pacienți conform IDF) din totalul populației (2% în 1). Dacă media mondială dublează numărul de pacienți în termen de 3-1,6 ani, atunci în Kazahstan numărul lor s-a triplat peste 1,7 ani.

În diferite țări, conform raportului Federației Internaționale de Diabet (2011), incidența diabetului este foarte diferită: în Rusia în 2011 – 7,6% din populație, Franța – 7,3%, Finlanda – 9,0%, Germania – 8%, Austria – 9,1%, Italia – 7,8%, Polonia – 10,6%, Suedia – 5,7%, Mexic – 18%, Israel – 9%, în Caraibe – de la 12,8 % în Antigua la 16,4% în Guyana; o creștere dramatică a numărului de pacienți din țările Golfului durează 10-15 ani: în Arabia Saudită – 16,2%, Kuweit – 15,9%, Qatar – 14,1%, Emiratele Unite – 12,6%; în Jamaica – 15,9%, China – 9,3%, India – 8,3%, Malaezia – 11,7%, Singapore – 11,1%, SUA – 10,8%, Uzbekistan – 4,9%, Kârgâzstan – 4,8% și media mondială – 8,5% [IDF Diabetes Atlas, 2011].

Principala metodă de tratament din 1922 a fost terapia de înlocuire cu preparate de insulină sintetică sau animală, terapia cu farmaceutice pe tablete, în combinație cu multe recomandări privind nutriția, activitatea fizică etc. Acest principiu vă permite să tratați, dar nu să vindecați, pacienții.

În ultimii ani în străinătate, după mulți ani de transplanturi de animale experimentale, metoda de transplant pentru tratarea diabetului a început să fie introdusă treptat în practica clinică, care presupune transplantarea insulelor pancreatice izolate (celulele B) ale pancreasului care produc hormonul – insulina. Scopul final al acestui principiu este vindecarea pacienților. Cel mai bun rezultat obținut astăzi este completarea sau compensarea completă a nevoilor organismului de insulină timp de aproximativ 2 ani după un transplant (aceasta este o operație unică, relativ simplă, de transplantare a unei suspensii constând din cel puțin 150-200 de mii de insule pancreatice purificate izolate din pancreas) .

Ideea transplantului de insule a apărut în urmă cu aproximativ 80 de ani, dar imposibilitatea tehnică de izolare și izolare a insulitelor pancreatice din țesutul pancreatic a fost un obstacol în implementarea sa. Principalul său potențial și avantajul evident este perspectiva reală existentă de vindecare a diabetului, spre deosebire de terapia de înlocuire a insulinei.

Punctul de cotitură a fost 1967, când, în cele din urmă, a fost propusă o metodă eficientă de izolare enzimatică a insulitelor din pancreas, care a schimbat radical situația [1]. Aproape imediat, în 1970, au început încercările de a transplanta experimental insule izolate cu animale afectate de diabet. În cadrul șefului unificator al Asociației Europene pentru Diabet (EASD), această lucrare a fost destul de activă în ultimii 30-35 de ani. În Europa există numeroase centre de transplantologie diabetică la diverse clinici și spitale, unde, pas cu pas, rezultatele transplantului sunt treptat îmbunătățite. Astăzi această metodă este clinică experimentală. Principalul dezavantaj al terapiei de înlocuire a insulinei este cunoscut și constă în faptul că de îndată ce administrarea hormonului este oprită, există o amenințare directă asupra vieții pacientului. Terapia de înlocuire a insulinei, în plus, prin definiția sa, nu are perspective de a deveni o metodă de tratare a unui pacient.

Insumed -   Tratamentul cu scorțișoară pentru diabet

Această problemă este acordată o atenție serioasă în Europa. În toate aceste decenii, finanțarea cercetării în această direcție crește doar treptat. Datele disponibile indică faptul că nu există nicio îndoială cu privire la perspectivele acestei lucrări și că, în timp, această metodă va deveni mult mai răspândită în Europa. Astăzi, câteva mii de pacienți au fost supuși unui transplant experimental de insulă. Esența metodei transplantologice de tratare a diabetului este următoarea:

Insulele pancreatice sunt izolate din pancreasul animalelor prin metoda enzimatică ca urmare a dezagregării fibrelor de țesut conjunctiv, sunt curățate și recultivate, după care sunt gata pentru transplant. Pentru izolarea insulelor, se folosește enzima de colagenază, care descompune fibrele de colagen ale țesutului pancreatic exocrin. În urma dezagregării, se formează o suspensie, formată din insule izolate, amestecate cu fragmente de țesut exocrin care a suferit dezagregare. Separarea lor se realizează prin crearea unui gradient de densitate folosind dextran sau ficoll. Insulele în acest caz ocupă un spațiu îngust în plan, de unde sunt selectate cu o pipetă. Curățarea finală se realizează prin spălare de 3-4 ori în soluție Hanks, urmată de centrifugare la viteze mici. Numărul de insule deteriorate este în medie de la 10 la 15% din numărul total de izolate. Cultivarea ulterioară se realizează într-un mediu nutritiv folosind factori de creștere și glucoză. Secțiunile histologice ale insulelor izolate înglobate în parafină sunt colorate cu insulină folosind una din mai multe metode pentru a analiza starea histostructurii și conținutul de insulină depusă (a se vedea fig.) 9.

  1. Țesutul pancreasului unui șobolan. Complex de zinc-insulină în celulele B. Reacție luminescentă la zinc cu toluenesulfonilamină chinolină; felie congelata; × 140. Echipa de cercetare diabetologică pentru droguri și foto.
  2. Insulă izolată pancreatică a unui șobolan neonatal. Pseudoizocianină dietilică. Histostructura neschimbată; conținut semnificativ de insulină în celulele B (fluorescență roșu aprins); × 140. Medicamentul și fotografia Grupului de Cercetări Diabetologice, 1990.
  3. Țesutul pancreasului unui șobolan. Pseudoizocianină dietilică. Histostructura neschimbată; conținut semnificativ de insulină în celulele B (fluorescență roșu aprins); × 140. Echipa de cercetare diabetologică pentru droguri și foto.
  4. Insulă izolată pancreatică a unui șobolan neonatal. Victoria 4R. Histostructura neschimbată; conținut semnificativ de insulină în celulele B (culoare violet); × 280. Echipa de cercetare diabetologică pentru droguri și foto.
  5. Țesutul pancreasului unui șobolan. Victoria 4R. Histostructura neschimbată; conținut semnificativ de insulină în celulele B (culoare violet), celule A (culoare roz); × 280. Echipa de cercetare diabetologică pentru droguri și foto.
  6. Insulă izolată pancreatică a unui șobolan neonatal. Metoda imunohistochimică. Histostructura neschimbată; conținut semnificativ de insulină în celulele B (culoare maro); × 280. Echipa de cercetare diabetologică pentru droguri și foto.
  7. Țesutul pancreasului unui șobolan. Metoda imunohistochimică. Histostructura neschimbată; conținut semnificativ de insulină în celulele B (culoare maro); × 280. Echipa de cercetare diabetologică pentru droguri și foto.

Figura 1. Insulele pancreatice izolate și purificate și țesutul pancreatic al șobolanilor și șobolanilor neonatali. Histostructura și conținutul de insulină în celulele B. Pregătirile și microfotografiile au fost obținute la Grupul de Cercetări Diabetologice din Karaganda (1977-2016)

Izolarea insulitelor animalelor adulte se realizează într-un mod ușor diferit: o soluție de colagenază este introdusă în artera pancreasului, adică. descompunerea fibrelor de colagen are loc din interiorul țesutului.

Transplantul în experiment se realizează mai des în țesutul hepatic prin injectarea unei suspensii de insulă în vena portală (există opțiuni de transplant sub piele, în patul muscular etc.) printr-o singură injecție de cel puțin 150-000. În prezent, rezultatele transplantului sunt studiate. în orice caz, însă astăzi sunt mai înclinați să transplanteze în țesutul hepatic.

Partea principală și cea mai scumpă a lucrării este obținerea de materiale, adică. culturi de insule izolate și purificate în cantitățile necesare. Componenta chirurgicală nu necesită o sală de operație specială (5-10% din toate eforturile și costurile).

Astăzi, departe de toate problemele legate de diabetul mondial sunt pe deplin rezolvate, dar, fără îndoială, o parte semnificativă a acestei căi a fost acoperită. Componenta principală este stabilirea metodelor pentru obținerea unei suspensii extrem de purificate de insule izolate (animale și donatori) în cantitățile necesare. În acest scop, grupurile sunt organizate în centre de transplant care se ocupă de problemele conexe, care pot fi împărțite condiționat în două grupuri: 1) îmbunătățirea tehnologiei de izolare și pregătire a insulelor pancreatice pentru transplant experimental (animal) și experimental-clinic (pacient); 2) studiul rezultatelor pe termen lung ale transplantului.

Astfel de divizii includ histologi și histochimiști extrem de profesioniști, cu experiență vastă ca histolog (fără studii superioare sau cu studii secundare).

În istologia și histochimia pancreasului din ultimii 50-60 de ani, nivelul lucrărilor manuale s-a păstrat aproape complet, deoarece este imposibil de integrat tehnologia mașinii în acest proces, similar cu încercarea înlocuirii lucrărilor manuale ale restauratorului de vopsire cu munca mașinilor; în funcție de experiența muncii noastre, dacă luăm toată munca manuală a unui histolog pancreatic ca 100% în 1964, atunci în 2015 volumul său a fost de cel puțin 95–98% din nivelul din 1964, adică. aproape nici o mișcare.

Insumed -   Simptome diabetice ale piciorului și tratament în stadiile inițiale și avansate

Pare adecvată următoarea versiune a unei eventuale organizări structurale a muncii.

  1. Grupa 1 (laborator) pentru îmbunătățirea izolării și cultivării insulelor pancreatice. Compoziție: preparatori histologi cu experiență și experiență îndelungată în histologie și histologie practică a țesutului pancreatic, precum și un supraveghetor (cu educație medicală), un specialist histolog cu experiență în histologie pancreatică practică.

Sarcinile grupului:

  1. îmbunătățirea metodelor de izolare a insulelor pancreatice prin enzimă colagenază;
  2. îmbunătățirea purificării materialului obținut;
  3. îmbunătățirea cultivării insulelor în pregătirea lor pentru transplant experimental de animale.

Obiective finale în conformitate cu obiectivele:

a) obțineți numărul maxim de insule cu un procent minim de deteriorate;

b) curățarea maximă a insulelor de impurități sub formă de fragmente de țesut exocrin, fragmente de insule neviabile deteriorate;

c) îmbunătățirea metodelor de cultivare: selectarea celor mai potrivite medii nutritive și a factorilor de creștere care contribuie la o mai bună și mai rapidă creștere și diferențiere a celulelor;

d) stăpânirea metodelor de încapsulare a insulelor în pregătirea transplantului.

  1. Transplantoterapie experimentală din grupul 2 Ar avea sens să o organizăm ca o structură separată funcțională în cadrul centrelor existente sau departamentelor de transplant din orașele unde există.

Din punct de vedere structural, grupurile pot face parte din diferite instituții, dar colaborează la același program. În alegerea histologilor și a supraveghetorilor, candidații ar trebui să:

  1. să poată îndepărta independent pancreasul de la un animal experimental, să-l fixeze, să efectueze cablarea, să pregătească secțiuni și să le coloreze folosind două dintre tehnicile descrise în acest articol cu ​​aceeași calitate sub supravegherea specialiștilor pentru toate procedurile;
  2. pentru manager, în plus, să aibă publicații care utilizează metode histologice pentru colorarea țesutului pancreatic. Grupul 1 (laborator) nu trebuie distras de educație, specializare, pregătire a studenților universitari, doctoranzi etc., care ar trebui să fie reflectate oficial în misiune și confirmate prin ordinea relevantă a șefului, interzicând toate activitățile străine, întrucât sarcina sa este să fie o unitate extrem de specializată și nu un centru de formare part-time.

Probele histologice ar trebui să fie selectate dintre histologii de laborator fără studii superioare, care au o experiență continuă, minim 5 ani, în istologie practică, ca asistent preparator sau histolog și au lucrat cu țesut pancreatic cel puțin 2-3 ani.

Despre finanțare. În toate etapele, ale căror sarcini sunt definite mai sus și asociate cu obținerea unei culturi de înaltă calitate a insulelor izolate, finanțarea nu este necesară în cadrul sistemului de granturi, ci constant, ca centre cu un profil diferit (perinatal, cardiologic etc.), în cazul în care apare această problemă. considerate de autoritățile superioare ca fiind cu adevărat relevante și că merită o astfel de decizie. Fără a rezolva problema finanțării, organizarea laboratorului poate fi suspendată. În cele din urmă, mai devreme sau mai târziu, va trebui probabil să ajungem la o soluție pozitivă a problemei de finanțare, deoarece incidența tot mai mare a diabetului va exercita o presiune din ce în ce mai mare.

Transplanturile de organe (inimă, rinichi etc.) sunt cântărite de nevoia de a rezolva o serie de probleme tehnice și organizatorice complexe, cum ar fi complexitatea tehnică a transplantului, căutarea donatorilor și incompatibilitatea imunologică. Este ușor de observat că transplantul de insule izolate este o procedură relativ simplă, într-o măsură mult mai mică, încărcată de problemele menționate mai sus, caracteristice transplanturilor de organe.

Având în vedere anumite dificultăți în ceea ce privește căutarea metodelor de monitorizare histologică a stării insulelor izolate, autorii oferă mai jos descrieri detaliate ale fixării și postării țesutului pancreatic și a metodelor de colorare a secțiunilor pentru insulină.

Procedura de colorare a țesutului pancreatic cu aldehidfuchsin Gomori în modificarea noastră

1) xilen – 5 min; 2) xilen nr. 2 – 5 min; 3) xilen nr. 3 – 5 min; 4) abs. alcool 100º Nr. 1 – 5 minute; 5) abs. alcool nr. 2 – 5 minute; 6) alcool 80º – 5 min; 7) apa. apa – 5 min; 8) agent oxidant – 2 min; 9) soluție de acid oxalic 2% până la decolorare; 10) dist. apa – 5 min; 11) aldehida-fuchsin ("MERCK", Germania; "SERVA", Germania) – 5-7 minute; 12) alcool acidifiat 70º 1 – pentru diferențiere; 13) 70 o alcool acidifiat nr. 2 – pentru diferențiere; 14) amestec Halmi – 1 min;

  1. Dist. apa – 5 min; 16) dist. apa – 5 min; 17) abs. alcool nr. 3 – 5 minute; 18) abs. alcool nr. 4 – 5 minute; 19) xilen nr. 3 – 5 min; 20) xilen nr. 4 – 5 min; 21) concluzia la balsam. Rezultat: insulina devine violetă (vezi fig., Poz. 1 și 2).

Metoda pentru colorarea țesutului pancreatic cu pseudoizocianină dietilică conform Coalson

1) xilen nr. 1 – 5 min; 2) xilen nr. 2 – 5 min; 3) xilen nr. 3 – 5 min; 4) abs. alcool 100º Nr. 1 – 5 minute; 5) alcool 90º – 5 min; 6) alcool 80º – 5 min; 7) apa apa – 5 min; 8) agent oxidant – 2 min; 9) soluție de 2% acid oxalic – până la decolorare; 10) dist. apa – 5 min; 11) 0,4% soluție apoasă de pseudo-izocianină (fabricată de SERVA, Germania) – 15-20 min; 12) alcool acidifiat 70º 1 – pentru diferențiere; 13) clătiți în 2 porții de dist. apă și lăsați la frigider 2 ore; 14) microscopie cu luminiscență (lungime de undă 360-370 nm; filtru de lumină galben excitant pe lampă; filtru de blocare a ocularului). Rezultat: insulina în celulele B fluoresce cu o lumină roșie aprinsă (vezi fig. Pos. 3 și 4).

Insumed -   Abordări moderne pentru tratamentul diabetului de tip 2 la bărbați

Procedura pentru colorarea țesutului pancreatic cu reactiv Victoria 4R (dimetilnaphthylmethane, indicele de culoare 42563)

soluţii:

  1. Soluție de gravare: lichid Buena refrigerat (100 ml) + alumocrom (3-4 g).
  2. Agent oxidant: soluție 0,3% KMnO4 (50 ml) + 0,3% soluție de acid sulfuric.
  3. Soluție "Victoria Blue": 96º alcool + reactiv "Victoria 4R" (1 g).
  4. Soluție de colorare: Soluție de albastru Victoria (25 ml) + 96º alcool (100 ml) + glicerină (300 ml) + 1% acid acetic glacial (25 ml). Cele mai bune rezultate au fost obținute la 10-20 de zile după prepararea soluției.

proceduri:

1) fixarea pancreasului în lichidul Buena 24-48 ore; clătiți cu alcool de 70º; 2) turnarea în parafină; 3) pregătiți secțiuni cu o grosime de 5 μm; 4) așezați scurt secțiunile de parafină în apă și apoi în soluția de gravare timp de 24-72 ore la +37 ºС; 5) clătiți secțiunile în apă curentă până la decolorare; 6) un agent oxidant – 3-5 minute; 7) clătiți bine în apă; 8) clătiți într-o soluție de bisulfit de sodiu 2-5% timp de 1 min; 9) clătiți bine în apă; 10) alcool 70º – 1 min; 11) colorarea cu o soluție de colorare timp de 45 de minute – 24 de ore la temperatura camerei, celulele B sunt colorate în albastru; 12) clătiți în apă; 13) să diferențieze alcoolul 70 ° pentru a decolora alte tipuri de celule; 14) clătiți în apă distilată timp de 1 min; 15) colorare cu o soluție de 0,5% phloxin timp de 30-120 s;

clătiți în apă distilată timp de 1 min; 17) soluție 5% acid de tungsten fosfor – 1-2 minute; 18) clătiți în apă curgătoare timp de 1-2 minute până când culoarea roșie a phloxinului se întoarce; 19) clătiți în apă distilată; 20) colorare cu o soluție apoasă de 0,5% de „Green Light” 1-2 minute; 21) deshidratarea de 2 ori în alcool de 96º, iluminarea în xilenă și turnarea în balsam.

Granulele insulinei din celulele B sunt colorate albastru. O celulă în roșu. Nucleii sunt roșii, țesutul exocrin este roz purpuriu, fibrele de colagen sunt verzi, fibrele elastice sunt albastre (vezi fig. Pos. 5 și 6).

Metoda imunohistochimică pentru colorarea insulinei în celulele B

Pentru vopsire, sunt utilizate seturi standard de reactivi produși de asociații de producție străine, în care numărul de proceduri de vopsire este minimizat și nu necesită un angajat înalt calificat. Cu prețul de colorare a unui medicament, metoda este de câteva ori mai scumpă decât metodele descrise mai sus și nu este comparabilă cu metoda aldehidă fuchsin și metoda Victoria 4R, care sunt semnificativ superioare metodei imunohistochimice pentru evaluarea stării histostructurii a insulelor pancreatice și a țesutului exocrin. Complexul insulină – anticorp prezintă o culoare brună saturată (vezi fig. Pos. 7 și 8).

Constatări

  1. Pe tema nr. 3 „Diabetul zaharat” în Republica Kazahstan nu există încă niciun institut al acestui profil sau centre de cercetare în domeniul diabetului, spre deosebire de primele două probleme ale medicamentului – nr. 1 „Boli cardiovasculare” și nr. 2 „boli oncologice” (există cardiocentri în aproape fiecare zonă, centre speciale de chirurgie cardiacă și centre de cancer, precum și institute de cercetare specializate). În viitor, datorită creșterii continue în intensitate a prevalenței diabetului, severitatea crescândă a problemei va duce mai devreme sau mai târziu la necesitatea unei astfel de structuri experimentale-clinice.
  2. Activitatea de rutină a pacientului și dureroasă este în această direcție, pentru care trebuie să fim pregătiți. Există o opțiune alternativă, și anume, în următorii 5-10 ani, ar trebui să se aștepte progrese suplimentare în acest domeniu, după care ne putem intensifica activitatea.
  3. Conform tendințelor actuale, tratamentul cu transplant pentru diabet are cu siguranță perspective bune de a deveni un tratament mai radical pentru diabet. Cheltuielile finale vor fi în mod evident mai mici: este suficient să spunem că, astăzi, este puțin probabil să fie necesare centre chirurgicale speciale pentru transplant de insulă în faza inițială, deoarece întreaga parte chirurgicală a transplantului de insulă nu prezintă astăzi nicio complexitate tehnică deosebită.

Managerul este recunoscător asociațiilor de producție Boehringer Mannheim >> (ΦPΓ),> (ΦPΓ), SERVA (Germania), FERAK (Germania), MERCK (Germania), SARTORIUS (Germania), Pharmacia Fine Chemicals ”(Suedia) pentru reactivi și preparate necesare pentru desfășurarea cercetărilor care au fost furnizate gratuit timp de mai mulți ani.

Pentru a preveni diabetul zaharat să intre într-o formă complexă care necesită un aport constant de insulină, este necesar să învățați cum să controlați boala. Cel mai recent medicament Insumed contribuie la acest lucru, care ajută la scăparea diabetului „la nivel celular”: medicamentul restabilește producția de insulină (care este afectată în diabetul de tip 2) și reglează sinteza acestui hormon (important pentru diabetul de tip 1).

zaharat Insumed - capsule pentru normalizarea glicemiei

Toate ingredientele care compun preparatul sunt făcute pe baza materialelor vegetale prin tehnica de biosinteză și sunt legate de corpul uman. Sunt bine absorbiți de celule și țesuturi, deoarece sunt aminoacizi care alcătuiesc structuri celulare. Componentele capsulei Insumed normalizați producția de insulină și reglați glicemia.

Informații detaliate despre acest medicament sunt disponibile în jurnalul medical Obzoroff.info. Dacă vrei să cumperi Insumed cu o reducere, apoi mergeți la site-ul oficial al producătorului.

Diabetus România